a. 色谱柱接头和系统管路注意事项所需工具：

3/8英寸扳手

5/16英寸扳手

小心拿取色谱柱。切勿让色谱柱掉落或撞击到坚硬表面，因为这样会扰乱柱床并且影响色谱柱性能。

1. 正确连接接入和接出色谱柱的1/16英寸外径不锈钢管路对于获得高质量色谱结果至关重要。

2. 使用标准不锈钢压力螺母接头时，确保其正确匹配1/16英寸外径不锈钢管路非常重要。拧紧或拧松压力螺母时，将5/16英寸扳手置于压力螺母上，并将3/8英寸扳手置于色谱柱末端接头的六角头上。

  注：在这个过程中，如果将任一扳手放在色谱柱管路的搭扳手平面上，会导致末端接头松动渗漏。

3. 如果在不锈钢压力螺母接头和色谱柱末端接头之间出现渗漏，则必须组装新的压力螺母接头、管路和锥箍。

4. 色谱柱识别标签上的箭头指示了正确的溶剂流向。

  正确连接接入和接出色谱柱的1/16英寸外径不锈钢管路对于获得高质量色谱结果至关重要。管路应接触到色谱柱末端接头的底部，二者之间不应有死体积。本应成功的分离可能因色谱柱发生额外峰展宽而失败，认识到这一点非常重要。下文详细介绍了如何选择合适的色谱柱接头和系统管路。

  由于缺乏行业标准，不同色谱柱制造商使用了不同类型的色谱柱接头。如果色谱柱末端接头的类型与现有的管路接头设置不匹配，可能对色谱分离性能产生负面影响。下文将解释沃特世和Parker的锥箍及末端接头之间的差别（图1）。不同类型的末端接头要求管路伸出锥箍的长度不尽相同。Symmetry色谱柱配备的沃特世末端接头要求管路伸出锥箍0.130英寸。如果您目前使用的不是沃特世色谱柱，则在安装Symmetry色谱柱前必须重置锥箍深度以获得理想性能。

  管路/色谱柱连接正确时（图2），管路应接触到色谱柱末端接头的底部，二者之间不应有死体积。

  流路中存在死体积会影响色谱柱性能。如果将Parker锥箍连接至沃特世末端接头，就可能出现这种情况（图3）。

注：如果将装有Parker锥箍的管路连接到沃特世色谱柱上，会出现死体积。

  只有一种方法可以解决这个问题：切断装有锥箍的管路末端，在管路上安装新的锥箍并重新连接。在拧紧螺母前，请确保管路接触到色谱柱末端接头的底部。

  相反，如果是将装有沃特世锥箍的管路连接到带Parker末端接头的色谱柱，则管路末端在锥箍到达合适的密封位置之前就会接触到底部。

这会留下空隙并造成渗漏（图4）。

有两种方法可以解决这个问题：

1. 进一步拧紧螺母。这样锥箍会向前移动并到达密封表面。切勿过度拧紧，因为这样可能会损坏螺母。

2. 切断管路，更换锥箍并重新连接?；蛘?，用可重置锥箍深度的一体化PEEK™接头（P/N：

PSL613315）替换常规压力螺母接头。

b．尽可能减少谱带展宽

  图5显示了管路内径对系统谱带展宽以及峰形的影响。由图可见，管路内径较大会引起峰展宽和灵敏度降低。

c. 安装卡套柱

  参见图6所示的安装说明。拧松旧卡套柱上的末端接头，使其与仪器入口和出口管路保持连接。

将新的卡套柱连接到接头之间，使标签上的液流流向箭头指向检测器。用手拧紧所有接头。

d. 测量系统谱带展宽体积

该测试应在配备UV检测器的HPLC系统上进行。

1. 从系统中取下色谱柱，换上一个零死体积两通。

2. 将流速设置为1 mL/min。

3. 以流动相稀释测试混合物，使检测器的灵敏度达到0.5~1.0 AUFS（可使用含有尿嘧啶、羟苯乙酯和羟苯丙酯的系统启动测试混合物；P/N: WAT034544）。

4. 进样此溶液2-5μL。

5. 测量4.4%峰高处的峰宽（5-sigma法）：

——5-sigma谱带展宽(?L) =

峰宽(min)×流速(mL/min)×(1000μL/1 mL)

——系统方差(μL²) =

(5-sigma谱带展宽)²/25

  对于典型HPLC系统，谱带展宽体积不应大于100μL±30μL（或方差400μL²±36μL²）。

  对于微内径（2.1 mm内径）系统，谱带展宽体积不应大于20~40μL（或方差不应大于160μL²~640μL²）。

e. 测量系统体积

  系统体积对于放大分离非常重要，因为它会在每次运行开始时产生一段等度保持。在小规模分离中，这段等度保持通常是数倍色谱柱体积，但对于制备型分离，等度保持可能只占制备级色谱柱体积的一部分。设计放大实验时必须考虑补偿该体积，以避免色谱峰畸变（图8）。

1. 取下色谱柱。

2. 使用乙腈作为流动相A，含0.05 mg/mL尿嘧啶的乙腈作为流动相B（消除无添加剂混合和粘度问题）。

3. 将UV检测器波长设置为254 nm。

4. 在目标仪器上运行初始方法中的流速和预期流速。

5. 采集运行100%流动相A时的基线5 min。

6. 将梯级设置为5 min后变为100%流动相B，然后继续采集数据5 min。

7. 测量100%流动相A和100%流动相B之间的吸光度差值。

8. 测定该吸光度差值的50%处的时间。

9. 计算梯度起点与50%点之间的时间差值。

10. 将时间差值乘以流速。